Нарушения цитокиновой регуляции у пациентов с диабетической ретинопатией

30 грудня 2016
1226
Резюме

Цель работы. Изучить уровень основных про- и противовоспалительных цитокинов в плазме крови, а также их продукцию иммунокомпетентными клетками периферической крови у пациентов с диабетической ретинопатией (ДР). Объект и методы исследования. Обследовано 113 больных сахарным диабетом (СД) 2-го типа, из которых 57 — с сопутствующей ДР (основная группа) и 56 — без ДР (группа сравнения). Группы рандомизированы по возрасту и полу. Контрольную группу составили 35 здоровых лиц. Результаты. У пациентов с ДР отмечена высокая концентрация провоспалительных цитокинов в плазме крови, при этом уровень фактора некроза опухоли-α в 2,66 раза выше, чем у здоровых лиц, и на 32,9% выше, чем в группе сравнения (p<0,05); интерлейкина (ИЛ)-1β — в 2,65 раза и на 21,9% (p<0,05); ИЛ-6 — в 6,33 раза и в 2,95 раза (p<0,05); ИЛ-8 — в 5,67 раза и в 2,34 раза (p<0,05) соответственно. Одновременно выявлено повышение спонтанной и митоген-индуцированной продукции этих цитокинов иммунокомпетентными клетками периферической крови, а также достоверно более высокий уровень активированных лимфоцитов и растворимых молекул адгезии. Выводы. У пациентов с ДР отмечено нарушение процессов адгезии и кооперации иммунокомпетентных клеток, в результате чего усиливается их активация, эффекторные функции и миграция в очаг воспаления в сосудистой стенке, что сочетается с повышением спонтанной продукции провоспалительных цитокинов и трансформирующего фактора роста-β, которые также оказывают повреждающее действие на органы-мишени. Именно их постоянная неконтролируемая гиперпродукция является ключевым моментом последующего повреждения органа зрения при СД с развитием более тяжелых форм ДР.

Введение

Сахарный диабет (СД) представляет одну из актуальнейших медико-социальных и экономических проблем современной медицины. В 2007 г. Всемирная организация здравоохранения назвала СД проблемой всех возрастов и всех стран, а рост заболеваемости позволил говорить о его глобальной эпидемии (Zhang P. et al., 2010; WHO, 2012).

В связи с постоянно увеличивающимся числом больных СД во всем мире повышается распространенность поздних диабетических осложне­ний. Одним из наиболее прогностически неблагоприятных ослож­нений СД является диабетическая ретинопатия (ДР), в 30–90% случаев приводящая к слепоте и инвалидности по зрению у лиц трудоспособного возраста в экономически развитых странах и существенно влияющая на качество жизни больных. На долю ДР приходится 80–90% всей инвалидности по зрению, обусловленной СД (Балаболкин М.И. и соавт., 1999).

В последнее десятилетие значительно расширяются научные сведения об эндотелии сосудов как активно функционирующей сложной метаболической системе. Патологические реакции, приводящие к развитию сосудистых осложнений, протекают на уровне эндотелиальных клеток, которые являются инсулиннезависимыми, что делает их уязвимыми для повреждающего действия гипергликемии. Беспрепятственное проникновение глюкозы в эндотелиальные клетки нарушает продукцию эндотелием вазоактивных факторов, факторов роста и пролиферации (Балаболкин М.И. и соавт., 1999; Балашова Л.М., 1999).

К основным патогенетическим механизмам развития ДР (стимуляция формирования микроаневризм и ремоделирование капиллярной сети с последующей ишемией) относят цитокиновый дисбаланс, включающий повышение уров­ня эндотелина, отмечаемое даже у пациентов с коротким стажем лечения СД (Балашова Л.М., 1999). Изучение изменений цитокинового профиля у больных ДР представляет большой интерес для получения более полного представления о патогенезе заболевания и разработке новых методов его лечения (Балаболкин М.И. и соавт., 1999; Балашова Л.М., 1999).

Цель работы — изучить уровень основных про- и противовоспалительных цитокинов в плазме крови, а также их продукцию иммунокомпетентными клетками (ИКК) периферической крови у пациентов с ДР.

Объект и методы исследования

Обследовано 113 больных СД 2-го типа, из которых 57 — с сопутствующей ДР (основная группа) и 56 — без ДР (группа сравнения). Группы рандомизированы по возрасту и полу. Контрольную группу составили 35 здоровых лиц без признаков СД и ДР.

Содержание про- и противовоспалительных цитокинов, уровень растворимых молекул адгезии sICAM-1 и sVCAM-1 определяли методом иммуноферментного анализа с помощью сертифицированных в Украине наборов для иммуноферментного анализа «Вектор-Бест» (Россия), «Pro Con» (Россия) и «Diaclon» (Франция). Для получения супернатантов клетки периферической крови (использовали разведенную в 4 раза гепаринизированную кровь) инкубировали в присутствии митогена (липополисахарид, фитогемагглютинин, кон-А- индуцированный синтез) и в среде культивирования (RPMI-1640 без митогена — спонтанный синтез) в течение 24–48 ч в 5% атмосфере СО2 при температуре 37 °С. После культивирования пробы центрифугировали в течение 10 мин при 400 g, собирали надосадочную жидкость для дальнейшего тестирования (Копелян И.И., Григорьева М.П., 1972).

Содержание активированных субпопуляций лимфоцитов (CD11b+, CD25+, CD54+, CD62L+, CD95+, HLA-DR+) в периферической крови определяли непрямым иммунофлюоресцентным методом с помощью моноклональных антител ЗАО «Сорбент-сервис» (Россия) (Передерий В.Г. и соавт., 1995).

Статистическую обработку данных проводили методами вариационной статистики (критерий Стьюдента) с использованием пакета прикладных программ Microsoft XP «Exсel», а также с помощью специализированной программы «STATGRAPHICS Plus версия 2.1».

Результаты и их обсуждение

В результате проведенных исследований у пациентов основной группы и группы сравнения отмечены значительные нарушения цитокинового профиля плазмы крови (рис. 1). У больных СД 2-го типа с ДР содержание фактора некроза опухоли (ФНО)-α выше, чем у здоровых лиц, в 2,66 раза и на 32,9% выше, чем в группе сравнения (p<0,05); интерлейкина (ИЛ)-1β — в 2,65 раз и на 21,9% (p<0,05); ИЛ-6 — в 6,33 раза и в 2,95 раза (p<0,05); ИЛ-8 — в 5,67 раза и в 2,34 раза (p<0,05) соответственно. Одновременно выявлено и достоверное повышение концентрации трансформирующего фактора роста (ТФР)-β в плазме крови в основной группе в 2,54 раза (p<0,05) по сравнению с контрольной, а в группе сравнения — в 1,87 раза (p<0,05). Полученные данные могут быть связаны с тем, что ФНО-α рассматривают как медиатор инсулинорезистентности при ожирении и СД, снижающий активность тирозинкиназы инсулинового рецептора, а также угнетающий активность внутриклеточных транспортеров глюкозы в мышечной и жировой тканях. Наличие у больных СД дислипидемии и атеросклероза также обусловливает специфические изменения в иммунной системе, поскольку за последние годы накоплено большое количество данных об участии иммунных механизмов в патогенезе атеросклероза и предложены иммунные теории атерогенеза (Балашова Л.М., 1999; WHO, 2012).

Рис. 1
 Концентрация цитокинов в плазме крови у пациентов с ДР
Концентрация цитокинов в плазме крови у пациентов с ДР

ТФР-β продуцируется макрофагами, лимфоцитами и дендритными клетками, а в печени — рекрутированными печенью макрофагами и Купферовскими клетками и играет ключевую роль в регуляции иммунного гомеостаза. Основные его эффекты связаны с угнетением пролиферации Т- и В-лимфоцитов, а именно цитотоксических CD8+-лимфоцитов, Т-хелперов 1-го, 2-го и 17-го типа, секреции Т-лимфоцитами ИЛ-2, -12. Дефекты сигнальных путей ТФР-β обусловливают усиление пролиферации и эффекторной функции иммунных клеток и могут привести к неконтролируемой форме иммунного ответа. При патологических состояниях именно ТФР-β является индуктором процессов фиброза, повышает синтез коллагена звездчатыми клетками печени. Гиперпродукция ТФР-β и других цитокинов инициирует и регулирует неоангиогенез, при этом патологический процесс в сетчатке часто прогрессирует и приводит к развитию пролиферации (Балаболкин М.И. и соавт., 1999).

С учетом выявленной высокой концентрации в плазме крови провоспалительных цитокинов проведено исследование продукции про- и противовоспалительных цитокинов ИКК периферической крови у больных СД и ДР. Спонтанная продукция представлена на рис. 2.

Рис. 2
 Спонтанная продукция цитокинов ИКК периферической крови у пациентов с ДР
Спонтанная продукция цитокинов ИКК периферической крови у пациентов с ДР

У больных ДР отмечен высокий уровень спонтанной продукции провоспалительных цитокинов как в сравнении с показателями у здоровых лиц, так и больных СД 2-го типа без ДР. В основной группе уровень спонтанной продукции ФНО-α был выше аналогичного группы сравнения на 41,01% (p<0,05), ИЛ-1β — на 32,8% (p<0,05), ИЛ-6 — на 25,1% (p<0,05), ИЛ-8 — на 24,3% (p<0,05), ТФР-β — на 75,8% (p<0,05), а ИЛ-4 — ниже на 28,6% (p<0,05). Это обусловлено наличием постоянной антигенной стимуляции аутоантигенами ткани глаза и пораженного эндотелия сосудов как проявления СД 2-го типа.

Показатели митогенстимулированной продукции про- и противовоспалительных цитокинов представлены на рис. 3.

Рис. 3
 Показатели митогенстимулированной цитокинсинтезирующей функции иммунокомпетентных клеток у пациентов с ДР
Показатели митогенстимулированной цитокинсинтезирующей функции иммунокомпетентных клеток у пациентов с ДР

Установлено повышение уровня митоген-индуцированной продукции провоспалительных цитокинов, особенно ФНО-α и ИЛ-1β, по отношению как к уровню здоровых лиц, так и больных СД без ДР.

С учетом высокой концентрации в плазме крови, а также высоких уровней спонтанной и митоген-индуцированной продукции проведено исследование количественного состава активированных субпопуляций лимфоцитов как их основных продуцентов.

В группе больных ДР отмечены более глубокие по сравнению с больными СД 2-го типа без офтальмологических осложнений, нарушения процессов активации: уровень Т-лимфоцитов, экспрессирующих рецептор ИЛ-2 (CD25+-лимфоциты), превышал показатель группы сравнения на 30,12% (p<0,05), количество активированных HLA-DR+-лимфоцитов — на 21,80% (p<0,05), а CD95+-лимфоцитов — в 2,82 раза (p<0,05). Также выявлено повышение относительного числа активированных лимфоцитов с фенотипом CD54+ на 26,80% (p<0,05), CD11b+-лимфоцитов — на 35,52% (p<0,05) и CD62L+-лимфоцитов — на 14,84% (p<0,05). Именно рецептор CD11b обеспечивает адгезию макрофагов и нейтрофилов к эндотелиальной стенке и служит лигандом ICAM-1, а СD62L (L-селектин) — обеспечивает адгезию и прилипание лимфоцитов к эндотелиальной стенке. Выявлена высокая концентрация в плазме крови растворимой сосудистой молекулы адгезии sVCAM, уровень которой в основной группе превышал таковой группы сравнения на 24,26% (p<0,05), а sІCAM-1 — на 21,75% (p<0,05). Следовательно более выраженный по интенсивности воспалительный процесс с высокими уровнями провоспалительных цитокинов приводит к более сильной активации ИКК и синтеза ими адгезивных молекул. Высокая концентрация в плазме крови растворимых молекул адгезии sICAM-1 и sVCAM-1, кроме того, сочеталась с повышенным уровнем экспрессии рецептора ICAM-1 (CD54+) на лимфоцитах периферической крови, а также рецепторов CD11b (лиганд СD 54 рецептора) и CD62L, которые обеспечивают прикрепление клеток к эндотелиальной стенке (таблица).

Таблица Содержание активированных субпопуляций лимфоцитов и растворимых молекул адгезии в периферической крови больных ДР (M±m)
Показатель Группа
основная (n=57) сравнения (n=56) контрольная (n=35)
СD25+-лимфоциты, % 18,23±1,15* 14,01±0,65** 9,1±0,39
HLA-DR+-лимфоциты, % 21,64±1,25* 17,34±1,06*, ** 13,1±1,27
СD95+-лимфоциты, % 11,82±0,21*, ** 5,08±0,22*, ** 3,12±0,04
CD54+-лимфоциты, % 25,12±1,13*, ** 19,81±0,73*, ** 12,06±1,15
CD 11b+-лимфоциты, % 36,21±1,8* 26,72±1,1*, ** 21,5±1,4
CD62L+-лимфоциты, % 40,93±1,2* 35,64±1,3*, ** 28,3±1,7
sVCAM, пг/мл 68,3±1,9* 56,1±1,7*, ** 18,6±1,9
sICAM-1, нг/мл 496,3±12,4* 399,4±12,7*, ** 275,5±17,28
*Достоверность различия показателя с контрольной группой (p<0,05); **достоверность различия показателя между группами; n — количество больных.

Именно адгезивные молекулы играют ключевую роль в процессах иммунного ответа и, безусловно, регулируют механизмы развития атеросклеротического воспаления, поскольку экспрессируются на одних клетках иммунной системы, связываются со своими контррецепторами и присоединяются друг к другу, что приводит к локальному их накоп­лению, развитию стаза и тромбоза в сосудах. К ранним маркерам, свидетельствующим об активности воспалительного процесса, особенно на ранних этапах заболевания, и относят ICAM-1, VCAM-1, Е-селектин. ICAM-1 относится к семейству иммуноглобулинов, а усиление его экспрессии вызывается такими цитокинами, как ИЛ-2 и ФНО-α. VCAM-1 — молекула адгезии сосудистых клеток, относится к семейству иммуноглобулинов, экспрессируется на поверхности активированного эндотелия (Передерий В.Г. и соавт., 1995).

Выводы

Таким образом, у больных ДР отмечено нарушение процессов адгезии и кооперации ИКК, в результате чего усиливается их активация, эффекторные функции и миграция в очаг воспаления в сосудистой стенке. Экспрессия адгезивных молекул на эндотелии и лимфоцитах является начальным этапом их рекрутирования в очаг воспаления, сопровождается возникновением широкого спектра иммунологических реакций, которые имеют в своей основе защитный характер, но в результате увеличенной длительности или интенсивности вызывают некротические или дистрофические изменения. Постоянная аутоактивация ИКК приводит к повышению спонтанной продукции провоспалительных цитокинов и ТФР-β, которые также оказывают повреждающее действие на органы-мишени. Именно их постоянная неконтролируемая гиперпродукция и является ключевым моментом последующего повреждения органа зрения при СД с развитием более тяжелых форм ДР.

Список использованной литературы

  • WHO (2012) Burden: mortality, morbidity and risk factors (http://www.who.int/mediacentre/events/annual/world_diabetes_day/en/index.html).
  • Zhang P., Zhang X., Brown J. et al. (2010) Global healthcare expenditure on diabetes for 2010 and 2030. Diabetes Res. Clin. Pract., 87(3): 293–301.
  • Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., Креминская В.М. (1999) Патогенез ангиопатий при сахарном диабете. Сахарный диабет, 1: 2–8.
  • Балашова Л.М. (1999) Морфологические особенности и иммуногемостатические механизмы развития диабетической ретинопатии. Вест. офтальмол., 115(5): 45–48.
  • Копелян И.И., Григорьева М.П. (1972) Разработка микромодификации культивирования клеток крови. Бюл. эксп. биол. мед., 9: 119–122.
  • Передерий В.Г., Земсков А.М., Бычкова Н.Г., Земсков В.М. (1995) Иммунный статус, принципы его оценки и коррекции иммунных нарушений. Здоров’я, Київ, 211с.
> Порушення цитокінової регуляції у пацієнтів із діабетичною ретинопатією

О.П. Вітовська, Т.С. Ахмад, Н.Г. Бичкова

Резюме. Мета роботи — вивчити рівень основ­них про- і протизапальних цитокінів у плазмі крові, а також їх продукцію імунокомпетентними клітинами периферичної крові у пацієнтів із діабетичною ретинопатією (ДР). Об’єкт і методи дослідження. Обстежено 113 хворих на цукровий діабет (ЦД) 2-го типу, з яких 57 — із супутньою ДР (основна група) і 56 — без ДР. Групи рандомізовані за віком і статтю. Контрольну групу становили 35 здорових осіб. Результати. У пацієнтів із ДР відзначено високу концентрацію прозапальних цитокінів у плазмі крові, при цьому рівень фактора некрозу пухлини-α вищий за такий у здорових осіб у 2,66 раза і на 32,9% вищий, ніж у групі порівняння (p<0,05); інтерлейкін (ІЛ)-1β — у 2,65 раза і на 21,9% (p<0,05); ІЛ-6 — у 6,33 раза і у 2,95 раза (p<0,05); ІЛ-8 — у 5,67 раза і у 2,34 раза (p<0,05) відповідно. Водночас виявлено підвищення спонтанної та мітоген-індукованої продукції цих цитокінів імунокомпетентними клітинами периферичної крові, а також достовірно вищий рівень активованих лімфоцитів і розчинних молекул адгезії. Висновки. У хворих на ДР відзначено порушення процесів адгезії та кооперації імунокомпетентних клітин, внаслідок чого посилюється їх активація, ефекторні функції та міграція у вогнище запалення в судинній стінці, що поєднується з підвищенням спонтанної продукції прозапальних цитокінів і трансформуючого фактора росту-β, які також спричиняють пошкоджувальну дію на органи-мішені. Саме їх постійна неконтрольована гіперпродукція і є ключовим моментом подальшого пошкодження органа зору при ЦД із розвитком тяжких форм ДР.

Ключові слова: цукровий діабет, діабетична ретинопатія, імунітет, цитокіни, молекули міжклітинної адгезії, спонтанна і мітоген-індукована продукція цитокінів.

Адрес для переписки:
Таха Салах Ахмад
01023, Киев, ул. Шелковичная, 39/1
Александровская городская клиническая больница
E-mail: [email protected]

Получено 04.11.2016